Биохимия и аналитическая биохимия

Абстрактный

Использование дихлорфлуоресцеина в качестве зонда для мониторинга влияния кальция на продукцию активных форм кислорода в митохондриях

Ольга Акопова, Людмила Колчинская и Валентина Носар

Дихлорфлуоресцеин (DCF) широко применяется для мониторинга продукции активных форм кислорода (ROS) в клетках и изолированных митохондриях. Нашей целью было сравнить различные подходы к использованию DCF для мониторинга образования ROS, сопровождающего транспорт Ca2+ в изолированных митохондриях. Влияние Ca2+ на продукцию ROS изучалось в митохондриях мозга и печени крыс с использованием двух режимов применения DCF: первый представлял собой предварительную загрузку исходной митохондриальной суспензии предшественником DCF дихлорфлуоресцеина диацетатом (DCFDA), а другой представлял собой добавление аликвот DCFDA непосредственно в инкубационную среду. Кальций увеличивал продукцию ROS в митохондриях мозга и печени как в стационарных, так и в неравновесных условиях, вызванных постепенным высвобождением цитохрома c и ограничением потока электронов. Используя предварительно загруженные DCF митохондрии, мы показали, что скорость образования ROS в условиях стационарного состояния линейно зависела от скорости циклирования Ca2+ и дыхания, стимулированного Ca2+. Переход в неравновесное состояние приводил к нелинейному росту образования ROS, которое также демонстрировало зависимость от концентрации Ca2+. В то время как в предварительно загруженных DCF митохондриях флуоресценция DCF тесно следовала за временным ходом транспорта Ca2+, в незагруженных митохондриях загрузка зонда мешала обнаружению образования ROS из-за продолжающегося изменения концентрации DCF в матричном пространстве. На основании экспериментов мы пришли к выводу, что предварительно загруженный в митохондрии DCF может служить подходящим зондом для мониторинга эффектов транспорта Ca2+ на продукцию ROS.