Журнал микробных и биохимических технологий

Абстрактный

Влияние предварительной обработки на обнаружение бактерий методом ПЦР в реальном времени - индикатор бактерий, энтерококк в качестве модели

Шин Гиек Го и Карина Ю-Хунг Джин

Текущие рекомендации по рекреационным водам (например, USEPA и ВОЗ) рекомендуют энтерококки в качестве индикатора как для пресноводных, так и для морских вод. Метод на основе культуры использовался в течение десятилетий для количественной оценки присутствия энтерококков. В 2012 году рекомендации USEPA по рекреационным водам включили qPCR в качестве альтернативного метода обнаружения энтерококков. Метод qPCR не требует длительного времени инкубации, как метод на основе культуры. Кроме того, он предлагает преимущества высокой специфичности и чувствительности обнаружения. Тем не менее, qPCR затруднен тремя основными ограничивающими факторами. Существует ограниченное количество целевых клеток в небольшом объеме образца, анализируемого qPCR, наличие ингибиторов, которые могут легко повлиять на чувствительное обнаружение qPCR, и сохранение свободной ДНК (ДНК, высвобождаемой из мертвых клеток), что вызвало ложноположительный сигнал в qPCR. Таким образом, предшествующая обработка имеет решающее значение для точности обнаружения qPCR. Три различных метода предварительной концентрации (i) фильтрация с нейлоновой мембраной; (ii) фильтрация с поликарбонатной мембраной и (ii) центрифугирование были исследованы на предмет их скорости восстановления. Было обнаружено, что фильтрация с поликарбонатной мембраной дает более высокую эффективность восстановления и постоянство результатов независимо от матриц образцов. Традиционная экстракция ДНК и два коммерчески доступных набора для экстракции ДНК были оценены в соответствии с чистотой извлеченной ДНК и относительной эффективностью восстановления экстракции. Результаты показывают, что коммерческий набор, QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen), показал наилучшие результаты. Было доказано, что применение кремниевых мембран в QIAamp® DNA Mini Kit улучшает восстановление ДНК с минимальным вмешательством ингибиторов. Моноазид этидия (EMA) и моноазид пропидия (PMA) были оценены на предмет их эффективности в снижении ложноположительного сигнала в qPCR. PMA, по-видимому, обеспечивает лучший вариант для снижения ложноположительного обнаружения ДНК в клетке с нарушенной мембраной.