Журнал исследований и терапии стволовых клеток

Абстрактный

Защита регенеративной терапии на основе стволовых клеток от ятрогенного канцерогенеза: трансгенная экспрессия DNASE1, DNASE1L3, DNASE2,DFFB, контролируемая промотором POLA1 в пролиферирующих и направленно дифференцирующихся устойчивых к аутологичным индуцированным плюрипотентным стволовым клетках человека, приводит к их гибели

Марек Малецки, Кристин ЛаВанн, Доминик Альгамбра, Чайтанья Додивенака, Сара Нагель и Раф Малецки

Введение: Наихудшим возможным осложнением использования стволовых клеток для регенеративной терапии является ятрогенный канцерогенез. Конечной целью нашей работы является разработка самозапускающегося механизма обратной связи, направленного на гибель всех стволовых клеток, которые сопротивляются направленной дифференцировке, продолжают пролиферировать и могут перерасти в опухоли. Конкретная цель: Конкретная цель была тройной: (1) генетически сконструировать конструкции ДНК для человеческих рекомбинантных DNASE1, DNASE1L3, DNASE2, DFFB, контролируемых промотором POLA; (2) биоинженерно разработать векторы, управляемые антителами анти-SSEA-4, доставляющие трансгены в человеческие недифференцированные и пролиферирующие плюрипотентные стволовые клетки; (3) вызвать гибель пролиферирующих и направленно дифференцирующихся стволовых клеток путем трансгенной экспрессии человеческих рекомбинантных ДНКаз (hrDNases). Методы: ДНК-конструкции для человеческих рекомбинантных DNASE1, DNASE1L3, DNASE2, DFFB, контролируемые промотором POLA, были генетически сконструированы. Векторы, нацеленные конкретно на стволовые клетки, экспрессирующие SSEA-4, были биоинженерными. Мононуклеарные клетки костного мозга здоровых добровольцев (BMMC) были индуцированы в человеческие аутологичные плюрипотентные стволовые клетки (hapiSC) с помощью неинтегрирующихся плазмид. Направленная дифференциация индуцированных стволовых клеток в эндотелиальные клетки была достигнута с помощью EGF и BMP. Направляемые антителами анти-SSEA 4 ДНК-векторы доставляли трансгены для человеческих рекомбинантных ДНКаз в пролиферирующие стволовые клетки. Результаты: Дифференциация плюрипотентных индуцированных стволовых клеток в эндотелиальные клетки была подтверждена путем выявления образования плотных и адгезионных контактов посредством трансгенной экспрессии рекомбинантных флуоресцентных белков слияния: VE-кадгерина, клаудина, zona occludens 1 и катенина. Пролиферация стволовых клеток была определена путем выявления трансгенной экспрессии рекомбинантных флуоресцентных белков, контролируемых промотором POLA, а также путем сообщения об экспрессии трансгенов для hrDNases. Экспрессия трансгенов для hrDNases привела к полному разрушению архитектуры хроматина и деградации геномной ДНК пролиферирующих клеток. Пролиферирующие стволовые клетки, но не дифференцирующиеся, были эффективно вызваны к гибели. Заключение: В настоящем документе мы описываем достижение подтверждения концепции стратегии, при которой трансгенная экспрессия генетически сконструированных человеческих рекомбинантных ДНКаз в пролиферирующих и направленно дифференцирующихся устойчивых стволовых клетках приводит к их гибели. Эта новая стратегия снижает риск ятрогенного канцерогенеза при терапии стволовыми клетками .