Генная технология

Абстрактный

Экспрессия рекомбинантного человеческого проинсулина в E. Coli путем изменения нетранслируемой и транслируемой области 5К¹

Аслам Ф., Латиф К., Васим Р., Наз С. и Ифтихар С.

Информационная РНК инициирует процесс трансляции, перенося код ДНК в транспортную РНК. Богатая полипурином последовательность, называемая последовательностью Шайна-Дальгарно, помогает определить положение стартового кодона, последовательность Шайна-Дальгарно отличается тем, что позволяет рибосоме быть построенной во внутреннем положении на мРНК посредством прямого связывания с этой последовательностью. Рибосомный сайт связывания на 5'-конце сайта инициации трансляции используется для связывания вторичной структуры мРНК, расстояние между RBS и стартовым кодоном влияет на трансляционную эффективность гена. В этом исследовании мы изменяем расстояние между сайтом связывания рибосомы и стартовым кодоном, чтобы получить различные соотношения трансляционной экспрессии. Для этой цели ген проинсулина клонировали в векторе pET21a, расстояние между сайтом связывания и стартовым кодоном было сохранено до 8 нуклеотидов. При таком расстоянии между сайтом связывания рибосомы (RBS) и стартовым кодоном экспрессия проинсулина составляла 30% от общего количества клеточных белков. Когда между ними находится 10 нуклеотидов, экспрессия снижается до 2-4%. При 12 нуклеотидах между RBS и стартовым кодоном экспрессия снижается еще больше до 1-2%. Поскольку эти попытки производятся случайным образом, проверка вторичных структур мРНК с помощью M-fold показала связывание между сайтом связывания рибосомы и началом гена проинсулина. Другая попытка была сделана путем включения десяти различных нуклеотидов в начало гена проинсулина, чтобы сделать вторичную структуру мРНК менее стабильной (ΔG=-5,5), что не приводит к значительному изменению экспрессии проинсулина в клетках BL21 с кодоном плюс. Существуют и другие факторы, контролирующие экспрессию белка, например, метаболическая нестабильность, быстрая деградация мРНК или накопление белка, которые могут подавлять экспрессию мРНК.