Журнал исследований и терапии стволовых клеток

Абстрактный

Очистка незрелых нейронов от дифференцирующихся потомков нервных стволовых клеток с использованием простого метода встряхивания

Хасан Азари, Шараре Шарифифар, Ройя П. Дариуш, Марьям Рахман, Джефф М. Фортин и Брент А. Рейнольдс

Цель: Обогащенные популяции нейрональных клеток являются ценными инструментами как для лабораторных исследований, так и для клеточной терапии. Однако доступные подходы к очистке клеток требуют дорогостоящего оборудования, такого как FACS или MACS, что ограничивает их всеобщую доступность. В этом исследовании мы разработали эффективный метод очистки незрелых нейрональных клеток от потомства дифференцирующихся нейральных стволовых клеток (dNSC) на основе их дифференциальных свойств прикрепления к субстрату без использования каких-либо дорогостоящих инструментов для разделения клеток. Методы: Нейральные стволовые клетки были собраны из ганглиозного возвышения мозга эмбриональных мышей 14-го дня с использованием анализа нейросфер. Затем нейросферы были диссоциированы на отдельные клетки и дифференцированы с использованием метода анализа нейробластов. После краткой трипсинизации культуру dNSC осторожно встряхивали со скоростью 150 об./мин в течение 30 мин, чтобы отделить верхние кластеры нейрональных клеток от лежащего под ними монослоя астроцитарных клеток. Выход очистки нейронов, загрязнение астроцитами и наличие делящихся клеток сравнивали с методом очистки MACS с использованием антитела PSANCAM. Результаты: В то время как выход нейронов 97,1 ± 0,45% был достигнут с использованием MACS; он достиг 97,9 ± 0,6% с использованием метода встряхивания, что не было существенной разницы. С другой стороны, процент астроцитов в подходе MACS составил 1,18 ± 0,15%, но он значительно снизился до 0,6 ± 0,15% при использовании метода встряхивания. Более того, 4,41 ± 0,23% и 5,3 ± 0,4% изолированных клеток в методах MACS и встряхивания, соответственно, были иммунореактивными делящимися клетками Ki-67, из которых 97,34 ± 1,6% и 97,9 ± 0,7% коэкспрессировали β III-тубулин, что подтверждает их нейрональную идентичность. Кроме того, на основе анализа клеток, формирующих нейронные колонии, метод встряхивания привел к образованию однородной популяции нейрональных клеток без какого-либо добросовестного загрязнения NSC. Выводы: Метод очистки встряхиванием обеспечивает простое, недорогое, эффективное и масштабное отделение незрелых нейронов от потомства dNSC, что потенциально приносит пользу как для базовых, так и для клинических приложений.