Журнал исследований и терапии стволовых клеток

Абстрактный

Скрининг инсерционного мутагенеза на основе LINE-1 для идентификации генов, участвующих в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток

Сон-Хун Ли и Дэнни Рангасами

Предыстория: Знание внутренних свойств эмбриональных стволовых клеток необходимо, прежде чем возможность использования этих клеток в терапевтических целях станет реальностью. Скрининг инсерционного мутагенеза широко используется для идентификации генов, достаточных для придания определенного фенотипа; однако применение таких подходов ограничено моделями мышей. Таким образом, существует необходимость в разработке новой системы ДНК-транспозона, которая позволяет использовать подходы к обнаружению генов в стволовых клетках.
Методы: Это исследование было проведено с целью изучения возможности использования ретротранспозона длинного вкрапленного ядерного элемента 1 (LINE-1) в качестве вектора-ловушки генов для идентификации генов, участвующих в поддержании и дифференциации эмбриональных стволовых клеток мышей.
Результаты: Мы разработали эписомальную, невирусную систему ретротранспозона LINE-1, используя области прикрепления каркаса/матрицы в остове нашего вектора. Этот вектор-ловушка генов содержит маркер GFP, экспрессия которого происходит только после успешного инсерционного мутагенеза. Используя этот вектор в сочетании с экспрессией GFP, мы успешно изолировали четыре отдельных клона эмбриональных стволовых клеток, которые демонстрируют нарушенные гены, включая два известных гена. Затем мы подтвердили идентичность этих генов с помощью метода обратной ПЦР и проверили их функцию в дифференциации клеток с помощью shRNA и недифференцированных маркеров эмбриональных стволовых клеток .
Выводы: Простота использования этого инсерционного мутагена и простота идентификации клеток с нарушенными генами по экспрессии GFP делают этот вектор LINE-1 многообещающим инструментом для обнаружения генов эмбриональных стволовых клеток и раковых стволовых клеток .