Журнал исследований и терапии стволовых клеток

Абстрактный

Микродиссекция интерзональных клеток мышей с помощью лазерного захвата: выбор слоев и прогнозирование выхода РНК

Флориен Дженнер, Герджо Дж.В.М. ван Ош, Мейрид Клири, Ирис Рибич, Ульрих Зауэр, Рене ван Верен и Питер Брама

Цель: Суставные хондроциты происходят из отдельной когорты клеток-предшественников, расположенных в так называемой интерзоне в эмбриональных развивающихся суставах. Мы провели это исследование 1) для того, чтобы определить, возможно ли идентифицировать промежуточные и внешние интерзональные слои гистологически (с использованием крезилового фиолетового) без дополнительной гибридизации in situ или иммуногистохимии; 2) чтобы установить, можно ли собрать достаточное количество РНК из каждого интерзонального слоя отдельных эмбрионов, чтобы провести анализ экспрессии генов; 3) чтобы разработать измерения, которые могут обеспечить оценку выхода РНК до дорогостоящих этапов амплификации. Методы: Клетки из внешней (OI) и промежуточной (II) интерзоны зарождающегося бедренно-большеберцового сустава и эпифизарного хряща (EC) бедренной кости и большеберцовой кости мышиных эмбрионов на 13,5 и 15,5 днях беременности были собраны с помощью лазерной захватной микродиссекции (LCM). Затем был проведен анализ микрочипов для подтверждения правильного выбора слоя. Площадь поверхности, собранная и значение серого (gv) микрофотографий, сделанных во время LCM, измерялись, и соответствующая относительная оптическая плотность (ROD) была рассчитана, а степень и значимость корреляции с выходом РНК были определены. Результаты: Клетки из OI, II и EC могли быть идентифицированы гистологически с использованием окрашивания крезиловым фиолетовым и были успешно собраны с LCM, что дало достаточное количество РНК для линейной амплификации и анализа микрочипов. Выход РНК значительно коррелировал с площадью поверхности собранной ткани, средним gv и соответствующим ROD. Выводы: В этом исследовании представлена ​​методика селективной лазерной микродиссекции и последующего анализа микрочипов мышиных интерзональных клеток промежуточного и внешнего слоя, а также представлен метод оценки выхода РНК путем измерения площади собранной ткани и расчета ROD. Мы рекомендуем собирать минимум 1×106 мкм2 13,5-дневных мышиных эмбрионов и 3×106 мкм2 15,5-дневных мышиных эмбрионов, чтобы получить приблизительно 10 нг общей РНК, которую можно использовать для линейной амплификации на основе T7 и последующего анализа с помощью микрочипов.