Биохимия и аналитическая биохимия

Абстрактный

Влияние макромолекулярного краудинга и ограничения на активность и структуру фермента в нативных и денатурирующих условиях

Стивен Лонг, Джеффри Канкел и Прашант Асури

В настоящее время общепризнанно, что как скученность, так и ограничение влияют на структуру и функцию фермента из-за эффектов исключенного объема; однако относительная эффективность этих сред в отношении судьбы белков остается неясной из-за отсутствия прямых сравнительных исследований. В этом исследовании мы изучаем использование биополимерного альгината для разработки in vitro платформы для исследования эффектов как скученности, так и ограничения на поведение двух модельных ферментов - пероксидазы хрена и β-галактозидазы. Альгинат в своей фазе раствора может использоваться в качестве агента скученности, а в своей гелевой фазе путем сшивания с использованием двухвалентных катионов - для инкапсуляции и ограничения белков, что позволяет нам использовать одну и ту же систему для прямого сравнения эффектов скученности и ограничения. Различные степени скученности и ограничения были достигнуты путем изменения концентрации альгината, и эти исследования продемонстрировали четкую зависимость активности фермента от степени скученности и ограничения. Более того, наши данные также предполагают, что ограничение белка в сшитых альгинатных гелях приводит к более высокому повышению активности фермента в условиях денатурации по сравнению с несшитыми переполненными средами. Результаты кинетических анализов были подтверждены с использованием структурных измерений денатурации белка с использованием флуоресцентного анализа 8-анилинонафталин-1-сульфоновой кислоты.