Одноклеточная биология

Абстрактный

Генотипирование индивидуально изолированных гамет из линий замещения хромосом Gossypium hirsutum

Ахмад Насир Азиз*, Абдул Муджид Якубу и Шерия Сингх Хамаль

Как важная культура для сельскохозяйственной безопасности США и устойчивого сельского хозяйства, генетическое улучшение хлопка требует разработки инновационных аналитических инструментов. Генетический анализ, основанный на отдельных гаметах, обеспечивает несколько преимуществ, включая минимальные требования к образцу, генетическую идентификацию мужского родителя и преодоление сложности полиплоидии из-за гаплоидной природы микроспор. В этом исследовании использовались линии замещения хромосом (CS) тетраплоидного хлопка (G. hirsutum x G. barbadense) с хромосомами 17 и 25 G. barbadense на фоне G. hirsutum. Индивидуально изолированные пыльцевые зерна проращивались для высвобождения их ДНК, а геномная ДНК увеличивалась с помощью модифицированной предварительной амплификации с удлинением праймера (PEP) с использованием набора MasterAmp™ Extra-Long PCR (EPICENTRE®, Мэдисон, Висконсин). Также из выбранных линий хлопка микроспоры, только что вышедшие из стадии развития тетрады, были индивидуально изолированы, и ДНК гамет была извлечена, а также амплифицирована посредством множественной амплификации смещения (MDA) с использованием набора REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN, Валенсия, Калифорния). Затем родительские образцы вместе с амплифицированными PEP и MDA отдельными ДНК гамет были проанализированы с использованием методов простого повтора последовательности (SSR), а также методов полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP), маркированных IRD800 и IRD-700 (Li-Cor, Линкольн, Небраска). Для анализа линий хлопка TM-1, 3-79, CS-B17 и CS-B25 были использованы девятнадцать пар праймеров SSR и 28 пар праймеров AFLP. Амплификация родительских маркеров SSR и AFLP как из зрелой пыльцы, так и из ранних свободных образцов микроспор предоставила уникальные инструменты для сравнительных генетических исследований с использованием электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле соответственно.