Фармацевтика Аналитика Акта

Абстрактный

Разработка быстрого и экономически эффективного анализа для скрининга обратимого ингибирования цитохрома P450 параллельно с ингибированием, зависящим от метаболизма Cyp3a4, с использованием рекомбинантных белков

Серенелла Замбон, Стефано Фонтана, Рафаэле Лонги и Махмуд Кайбаф

В настоящем исследовании мы разработали высококачественный, быстрый и экономически эффективный анализ ингибирования CYP450, который действительно способен обнаруживать как обратимое, так и зависимое от метаболизма CYP3A4 ингибирование (MDI), используя рекомбинантно экспрессированные изоформы P450 и флуорогенные субстраты P450. Изоформа CYP3A4 проверяется с помощью диэтоксифлуоресцеина (DEF) в качестве зондового субстрата. Затем значения IC50 могут быть рассчитаны для тестовых соединений по отношению к изоформе CYP3A4 на основе скорости метаболизма зондового субстрата, измеренной в течение 10 минут. Кроме того, зависимый от метаболизма CYP3A4 ингибирующий потенциал тестовых соединений определяется путем продления на 30 минут определения скорости метаболизма диэтоксифлуоресцеина и расчета значений IC50 каждые 5 минут периода инкубации. Оценку ингибиторного потенциала CYP3A4, зависящего от метаболизма, тестируемых соединений можно определить, сравнивая значения IC50, измеренные после 10 и 30 минут инкубации. Инкубация проводилась с использованием селективных ингибиторов CYP миконазола для прямого ингибирования P450 и тролеандромицина для ингибирования, зависящего от метаболизма, в качестве положительных контролей. Весь процесс скрининга был полностью автоматизирован в формате 96-луночного планшета с использованием роботизированной технологии обработки жидкостей Hamilton в сочетании с двумя флуориметрами (Tecan) и пользовательским управлением лабораторной информацией. Этот анализ в настоящее время применяется для скрининга соединений на ранней стадии процесса оптимизации свинца и выявления тех соединений, которые вызывают обратимое и/или основанное на метаболизме ингибирование CYP450 и, следовательно, прогрессируют те молекулы или химические ряды с наименьшим возможным потенциалом DDI. Большое количество данных, полученных с помощью этого анализа, также может быть использовано для создания информативной базы данных и улучшения прогностических моделей.