Глобальный журнал биологии, сельского хозяйства и медицинских наук

Абстрактный

Разработка, оптимизация и валидация метода проточной цитометрии для количественного определения Igg-анти-D (rho) в промышленном контроле процесса производства анти-rho-гамма-глобулина

Серхио А Овьедо, Сусана Витали, Хорхе Зарзур

Одной из основных причин гемолитической болезни новорожденных является выработка анти-D антител в ответ на постоянную антигенную нагрузку у беременных матерей, у которых в эритроцитах отсутствует антиген D. Для предотвращения осложнений проводится мониторинг уровня анти-D антител у беременных женщин, а сенсибилизация предотвращается профилактическим применением анти-D иммуноглобулина (IgG анти-D). На сегодняшний день мониторинг и титрование анти-D в плазме и готовых продуктах (IgG анти-D) осуществляется непрерывным проточным анализом с помощью автоанализатора Technicon, радиоиммунного анализа (РИА) и иммуноферментного анализа (ИФА). В нашей лаборатории для количественного определения анти-D антител гамма-Rho UNC и продуктов процесса обработки была разработана «домашняя» методика проточной цитометрии в качестве альтернативного теста референтному методу Европейской фармакопеи. Поликлональные антитела против Rho и анти-FITC (флуоресцеинизотиоцианат)-меченый человеческий IgG использовались для измерения концентрации анти-D антител в коммерческом препарате гамма-глобулина, полуобработанной и человеческой плазме. Метод был разработан с использованием 1-го международного стандарта ВОЗ для анти-D IgG (69/419). При концентрации эритроцитов, используемой в методе (5 x 104 клеток/мкл), не наблюдается помех от аутоагглютинации. Полученная кривая зависимости реакции от дозы (MFI против Log C) была линейной в принятом рабочем диапазоне, представляя коэффициент корреляции 0,99. Тесты на специфичность и восстановление были удовлетворительными, отрицательные контроли показали незначительные уровни флуоресценции и не оказали серьезного вмешательства в определение. Зная, что уровни антигена анти-D участков эритроцитами различаются в зависимости от фенотипа, наши результаты показывают, что глобулы с фенотипами R1R1 представляют наилучшую производительность для этого теста и могут быть заменены при необходимости клетками R1R2. Метод был валидирован в соответствии с критериями группы экспертов N°6B NIBSC и Европейской фармакопеи, которые стандартизировали аналогичную процедуру для применения при оценке анти-D. Проточная цитометрия позволила получить точные, точные, чувствительные и специфические определения при различных концентрациях анти-D (100-0,9 мкг/мл) и в различных биологических матрицах, таких как готовый продукт, предварительно заполненный концентрированный продукт и фракция II метода Кона. Преимущества, обнаруженные при применении этого метода, в дополнение к относительно низкой стоимости, включают сильный сигнал флуоресценции, не требующий усиления, использование сильно разбавленных образцов, что минимизирует риск агглютинации IgM-Anti D или полимерами. Это простой, быстрый и надежный метод определения уровней анти-D в сыворотке или количественной оценки концентрации в растворе иммуноглобулина.