Журнал расстройств питания и терапии

Абстрактный

Клиническое питание 2019: Влияние чая комбуча на целостность кишечника у мышей - Элахех Махмуди - Университет медицинских наук Альборза

Элахех Махмуди

Цель(и): Окислительный стресс участвует в патогенезе гиперпении, фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний и смертности. Несколько исследований на людях показали, что каротиноиды томата могут влиять на различные аспекты здоровья человека. В ходе этой презентации автор рассмотрит два вопроса ??? а) балансировка реакции клеток кожи на УФ-облучение и б) снижение повышенного жизненно важного показателя. а) Несколько исследований на людях показали, что каротиноиды томата могут уменьшать вызванное УФ-излучением повреждение, уменьшая эритему и улучшая баланс между выработкой и распадом коллагена. Мы предположили, что смесь каротиноидов томата вместе с полифенолами может обеспечить лучшую защиту кожи, чем ожидалось от суммирования их активности. Действительно, мы поняли, что смеси комплекса питательных веществ томата (содержащего ликопен) с экстрактом розмарина (содержащим полифенол карнозную кислоту) синергически снижают маркеры воспаления и индуцируют антиоксидантную активность в клетках кожи, прежде всего за счет снижения матриксной металлопротеиназы (ММП), и, таким образом, могут уменьшить распад коллагена и замедлить старение кожи. б) Гиперпения может быть фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и смертности. Мы провели анализ зависимости «доза-реакция», чтобы выявить оптимальную эффективную дозу добавки комплекса питательных веществ томата для поддержания нормального показателя у лиц с гипертонией. Материалы и методы:

Кишечник, похожий на сито, был убежден в двух коллекциях молодых и взрослых животных, использующих декстран сульфат натрия в напитке в течение семи дней. Ранее fKT управлялся с мышами, страдающими колитом, и относился к соответствующим по возрасту нормальным и нелеченным животным с колитом.

Приготовление чая комбуча (KT)

Черный чай (Голестан, Тегеран, Иран) добавляли в кипящую воду (1,2% по массе/объему), перемешивали и оставляли завариваться на 10 минут. Затем чай фильтровали через стерильное сито, и в чае растворяли сахарозу (10%). Для организации KT 200 мл охлажденного чая инокулировали 3% по массе/объему чайного гриба плюс 10% по объему жидкости KT, которая была предварительно ферментирована. Затем сбор оставляли ферментироваться, инкубируя при 28 °C в течение 14 дней. Для формирования отфильтрованного KT (fKT) полученный ферментированный чай центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 минут и фильтровали с использованием целлюлозного фильтра 0,45 мкм, оснащенного воздушным насосом.

Экспериментальные группы и дизайн исследования

Male NMR mice were purchased from the Pasteur Institute Experimental Animal Center, Tehran, Iran. All animals were housed for one week before the experiments began in light- and temperature-regulated rooms at the traditional animal department of Alborz University of Medical Sciences.  All experimentations were permitted by the native ethical group (reference No Abzums.Rec.1395.51) and performed consistent with Animal Care and Use Protocol of Alborz University of Medical Sciences.

The animals were divided into two groups of young and old. Each group was then further subdivided into two groups (8 in each) including normal and colitis-induced. because the figure indicates, each of colitis-induced old or young groups was further subdivided into two subgroups, including colitis-induced with no treatment and colitis-induced treated with fKT. The study was performed in three phases. within the initiative , DSS-induced colitis was found out in young (2 months) and old (16 months) mice during a period of 21 days during which weight loss and therefore the clinical score were evaluated and compared with the age-matched healthy animals. within the second phase, the effect of fKT administration on survival analysis and therefore the clinical score were evaluated during a period of 21 days. After completion of phase I clinical trial and II of the study, molecular and histological evaluations were performed on young and old healthy controls, DSS-induced colitis, and DSS-induced colitis treated with fKT animals in phase III clinical trial . Considering the deathrate and clinical signs that occurred within the animals with colitis, animals at this phase of the study were sacrificed on day 14 after the start of the study.

Colitis induction

Colitis was induced on day 0 using administration of drinking water containing 3.5% (w/v) dextran sodium sulfate salt (DSS) (40000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Germany) per mouse per day. The animals and clinical signs of disease were daily monitored, indicated by weight loss, occurrence of blood in the stool or around the rectum, and diarrhea until day seven after the colitis induction. Weight loss was determined by comparing the body weight for each mouse to the baseline body weight and expressed as a percentage of weight loss. Other symptoms were scored according to the previously suggested system by Siegmund et al. Briefly, the different signs for stool consistency were scored as follows: score 0, well-formed pellets; score 2, pasty and semi-formed stools that did not adhere to the anus; score 4, liquid stools that did adhere to the anus. The different signs for bleeding were scored as follows: score 0, no blood measured using the Hemoccult system (Beckman Coulter); score 2, positive Hemoccult; score 4, gross bleeding. Animals with borderline scores were given a one-half score.

Histological and histopathological analysis

To perform histological evaluation of the colon, the animals were sacrificed under ether anesthesia after the last treatment with beverage or fKT. Colon was initially flushed with 1x ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to get rid of feces completely. Tissue samples of the colon were then removed, fixed in 10% buffered formalin, and processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 μm thickness were taken and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). The stained sections were examined with an Olympus cX41 microscope and photographed using an Olympus D330 camera . Damage score ranged from 0 to 4 scale was judged based on: inflammation represented by number and extent of leukocyte infiltration, epithelial defects represented by the severity of injury to the somatic cell layer, crypt atrophy estimated visually for the percent of atrophy within the crypts, edema, polymorphonuclear cells(PMNs) infiltration, and mucosal disruption.

Immunofluorescence studies of ZO-1 and ZO-2 expression

Sections of 5 µm paraffin-embedded colon tissues were prepared from each sample and then dewaxed, hydrated, and incubated in a protein block solution. Subsequently, the sections were incubated with the primary rabbit monoclonal ZO-1 or ZO-2 antibody (diluted 1:100 in 0.01 mol /L PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, UK) followed by incubation with a goat anti-rabbit Alexa flour 488 (ab150077, Abcam, Cambridge shire, UK). The images were captured using a DeltaPix fluorescent microscope (Smorum, Denmark) and evaluated independently by two expert pathologists.

Analysis of gene expression by real-time PCR

Total RNA was extracted from ~50 mg of frozen colon tissue using guanidine/phenol solution (reagent lysis Qiazol-USA) consistent with the manufacturer’s instruction. the standard and quantity of RNA concentrations were monitored employing a NanoDrop 2000c (Eppendorf, Germany). Then, 1 μg RNA was reversely transcribed to DNA using Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Munich, Germany), consistent with the manufacturer’s instructions. The relative expression of mRNA for GAPDH, ZO-1, and ZO-2 decided by preparing reaction mixer with PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Denmark) and gene-specific primers with diluted cDNA and final volume made up to 10 μl with nuclease-free water. Quantification and analysis were administered in ABI real-time PCR. The sequences of primers, designed by Integrated DNA Technologies, were forward 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ and reverse 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ for ZO-1 and forward 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ and reverse R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ for ZO-2. The efficiencies for primers utilized in the study varied between 95% and 105%. Primer pairs were validated to make sure the right size of the PCR product and therefore the absence of primer dimers. The GAPDH gene was chosen as an indoor control against which mRNA expression of the target gene was normalized. The resultant organic phenomenon level was presented as 2-ΔCt, during which ΔCt was the difference between Ct values of the target gene and GAPDH.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 7.01. Data are presented as means± SD. ANOVA was wont to indicate any significant difference between the groups. Survival rates were illustrated using Kaplan–Meier plots and compared using the log-rank test. Value of P was considered statistically significant when it had been but 0.05.

Results:

Characteristics and clinical course of DSS-induced colitis

Колит, вызванный DSS у мышей, является распространенной животной моделью для изучения патогенеза колита и оценки терапевтических подходов. Эта модель была обнаружена в нашей лаборатории и отслеживалась в течение 21 дня (фаза I). Для этого самцам мышей NMR вводили 3,5% DSS в напитке в течение семи дней. Животных ежедневно проверяли в течение всего исследования на выживаемость, потерю веса и клинические признаки колита, включая кровотечение и диарею, и сравнивали со здоровыми животными того же возраста. Анализ выживаемости молодых животных, получавших DSS, показал, что 66% и 33% животных были живы на 7 и 14 дни соответственно, и все они умерли на 2 день. В случае старых животных, получавших DSS, анализ выживаемости показал, что 66% и 50% животных были живы на 7 и 14 дни соответственно, и все они умерли на 21 день. Была большая потеря веса в группах молодых и старых животных, получавших DSS, по сравнению с соответствующими по возрасту здоровыми животными. Молодые мыши, получавшие DSS, потеряли примерно 10% и 46% своего веса на 7 и 14 дни соответственно. Старые мыши, получавшие DSS, потеряли примерно 13,5% и 15% своего веса на 7 и 14 дни соответственно. Что касается признаков расстройства пищеварения, кровотечение и диарея наблюдались у молодых и старых мышей, получавших DSS, на 2 и 3 день после введения DSS соответственно. Полученные результаты показывают, что у молодых мышей, получавших DSS, наблюдаются более серьезные клинические признаки и более низкая выживаемость, чем у старых мышей, получавших DSS.

Гистологические наблюдения

Гистологический анализ окрашенных гематоксилином и эозином срезов тканей (рисунок 6) всех молодых и старых мышей, которым вводили DSS, показал повышенную инфильтрацию ПМН, потерю крипт, дефект эпителия, нарушение слизистой оболочки, апоптоз, отек и истончение слизистой оболочки по сравнению со здоровыми мышами того же возраста. Лечение с помощью fKT уменьшило степень повреждения, хотя и не вызвало полного возвращения к здоровому состоянию по схеме, применяемой в ходе этого исследования. Примечательно, что у старых здоровых мышей наблюдалась большая инфильтрация ПМН, потеря крипт и отек, чем у молодых здоровых животных. Как показано на рисунке 6c, толщина слизистой оболочки уменьшалась при введении DSS, поскольку клинический балл увеличивался как у молодых, так и у старых с колитом, вызванным DSS. Данная работа частично представлена ​​на 24- ^й  Международной конференции по клиническому питанию , которая проходила с 4 по 6 марта 2019 года в Барселоне, Испания.