Генная технология

Абстрактный

Характеристика мономерных белковых доменов, которые специфически связываются с высококонсервативной 100-пн ДНК-мишенью в генах рРНК

Элоди Карнюс, Мари-Вероник Дематтеи, Софи Кастере, Гийом Карпантье, Фабьен Палаццоли, Соленн Бир, Кристоф Брессак и Ив Биго

Доказательства концепции показали, что кластеры хромосомных генов, кодирующие рибосомальную РНК (рРНК), составляют локусы интеграции доставки генов, оптимальные для экспрессии трансгенов. Однако, поскольку гомологичная рекомбинация эффективна для интеграции сегментов ДНК в эти гены у животных, требуются новые молекулярные инструменты для создания систем, способных нацеливаться на молекулы в непосредственной близости от генов рРНК.

 Мы исследовали свойства нескольких доменов связывания ДНК (DBD), способных специфически распознавать мотив в пределах 100-пн области генов рРНК, которая на 99-100% сохраняется среди эукариот. Наши результаты показывают, что два Myb-подобных DBD, происходящих из эндонуклеаз, кодируемых ретротранспозонами R2 non-LTR, являются многообещающими кандидатами, поскольку они i) специфически распознают с высокой аффинностью 20-пн сайт связывания, расположенный в ожидаемой геномной мишени рРНК, ii) действуют как мономеры, iii) содержат сигнал ядерной локализации, iv) остаются функциональными при слиянии с другим доменом и v) не изменяют функциональность белка, с которым они слиты. Однако результаты, полученные in vivo с несколькими слияниями R2DBD, показывают, что два свойства еще предстоит спроектировать, прежде чем эти DBD можно будет интегрировать в молекулярную систему нацеливания, направленную на гены рРНК. Первая касается способности R2DBD располагаться в ядрышке, органелле, в которой находятся гены рРНК. Вторая — тенденция R2DBD накапливаться в определенных частях ядер, что ограничивает его диффузию внутри ядер. Обсуждаются решения, позволяющие обойти эти текущие ограничения. Наши результаты предоставляют важную информацию о свойствах R2DBD и нацеливании плазмидной ДНК внутри ядер. Их необходимо будет дополнительно проанализировать с трех сторон: неиспользованные преимущества R2DBD, возможности и ограничения пептидов слияния для нацеливания интеграций невирусного вектора и альтернативы пептидам слияния для нацеливания векторов.