Биохимия и аналитическая биохимия

Абстрактный

Биотехнологический конгресс 2015 г.: Химически модифицированный цистеин в процессах с подпиткой и его влияние на удельную продуктивность CHO - Элин Циммер, Merck Millipore

Алин Циммер

Промышленное культивирование клеток млекопитающих с подпиткой используется для производства терапевтических белков, таких как моноклональные антитела. Помимо среды, обеспечивающей начальный рост, необходимо подпитка для улучшения роста, жизнеспособности и выработки антител. Установленные коммерческие системы включают слегка кислую концентрированную основную подпитку и отдельную щелочную аминокислотную подпитку, содержащую L-тирозин и L-цистеин. Поскольку L-цистеин нестабилен из-за его димеризации в цистеин в присутствии воздуха и металлических катализаторов, необходимо стабильное производное L-цистеина для включения всех аминокислот в нейтральные по pH подпитки. Такие системы с одной подпиткой предпочтительны для упрощения схем подпитки и повышения общей надежности процесса за счет стабилизации сигналов как pH, так и DO. Здесь мы предлагаем использовать химически модифицированный цистеин в сочетании с динатриевой солью фосфортирозина в промышленном процессе с одной подпиткой с подпиткой, применимом как в малых масштабах, так и в биореакторах. Эксперименты с клеточной культурой проводились либо в спин-пробирках, либо в биореакторах с суспензионной клеточной линией CHO, экспрессирующей человеческое моноклональное антитело. Плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность измеряли с помощью автоматического устройства для подсчета клеток. Анализ отработанных сред супернатантов проводили на аминокислоты после предколоночной дериватизации и анализа UPLC, а на витамины — с помощью LC-MS/MS.

Измерения метаболитов проводились с помощью Cedex Bio HT с использованием фотометрических и турбидиметрических методов. Характеристика моноклонального антитела проводилась с использованием маркировки 2-AB для анализа гликанов, cIEF для анализа вариантов заряда и LC-MS/MS для экспериментов по картированию пептидов. Исследования стабильности корма, содержащего модифицированное производное цистеина, показали, что молекула была стабильной и что L-цистеин или L-цистин не высвобождались в течение трех месяцев при хранении при комнатной температуре или 4 °C. Более того, не наблюдалось никаких изменений цвета корма с течением времени. Маломасштабные эксперименты с партиями, в которых L-цистеин заменялся тем же количеством химически модифицированного цистеина, не показали никаких изменений в профилях роста или жизнеспособности. Использование модифицированного производного цистеина в маломасштабных процессах с подпиткой показало сопоставимую максимальную плотность жизнеспособных клеток, длительную жизнеспособность и повышенный титр по сравнению с установленной системой с двумя подпитками.

Эксперименты с биореакторами подтвердили увеличение удельной производительности, описанное в малых масштабах, когда стратегия одиночной подачи сравнивалась со стратегией двух подач. Углубленная характеристика моноклонального антитела не выявила никаких изменений в гликозилировании или зарядовом варианте, тогда как эксперименты по картированию пептидов не смогли обнаружить никакой интеграции модифицированной аминокислоты в последовательность моноклонального антитела. Млекопитающие заботились о формах сгустков для создания моноклонального нейтрализатора (mAb), зависящих от жизненно важных забот о нескольких добавках, например, глюкозе, питательных веществах и аминокислотах, чтобы увеличить время культивирования и улучшить выработку белка[1]. В реальных процедурах L-цистеин и L-тирозин заботятся независимо при растворимом pH из-за их низкой устойчивости и низкой растворимости при нейтральном pH, что приводит к пикам pH и осаждению[2]. Для улучшения передовых форм обе аминокислоты были искусственно изменены для улучшения их конкретных профилей прочности и растворимости. Предыдущая работа показала, что динатриевая соль фосфотирозина (PTyr2Na) является устойчивым подчиненным L-тирозина и может использоваться в беспристрастных pH-контролях без заметного влияния на образ жизни или качественные характеристики mAb[3]. Здесь мы представляем результаты, полученные с использованием дочернего L-цистеина в беспристрастной pH-структуре с одним кормом.

Надежность вспомогательного вещества L-цистеина оценивалась в беспристрастном pH, CellventoTM Feed-220 в течение квартала года при комнатной температуре или 4 ° C. Для групповых обществ использовался клон CHO K1, связывающий человеческое mAb. Развитие действовало в среде Cellvento™ CHO-220, как указано в инструкции по процедуре. Для контроля использовались Cellvento™ Feed-220 и другой основной цистеин/тирозиновый корм, хотя в процессе единой подачи вспомогательное вещество L-цистеина и PTyr2Na были законно солюбилизированы в беспристрастном pH, первичном корме. Испытания проводились в пробирках и биореакторах объемом 1,2 л. Развитие и целесообразность наблюдались с использованием ViCell®, титр был разрешен с использованием Cedex Bio HT, а явная рентабельность определялась в зависимости от титра, возможной толщины клеток и ослабления.

Для исследования отработанной среды измерение вспомогательного вещества L-цистеина и аминокоррозионного вещества выполнялось с помощью UPLC с использованием реагента AccQ·TagTMUltra. Для оценки способности подачи реагировать H2DCFDA добавлялся к беспартийному pH, Cellvento™ Feed-220 усиливался или нет подчиненным веществом. Для оценки внутриклеточных видов реагирования клетки метились карбокси-H2DCFDA и оценивалась флуоресценция. Для оценки предела клеток для использования вспомогательного вещества клеточные лизаты были подвергнуты спайкингу, а сформированные элементы оценивались с помощью UPLC. Для исследования mAb N-гликозилирование измерялось с помощью HPLC после маркировки 2-AB, в то время как изменения заряда разрешались с помощью cIEF.

Исследование вспомогательной устойчивости L-цистеина в нейтральной подаче pH не выявило никаких изменений в подчиненной фиксации или выбросе L-цистеина/L-цистина при хранении более четверти года при комнатной температуре или 4°C. Не наблюдалось никаких осадков или изменений в затенении, что свидетельствует о том, что подчиненный был устойчив в испытанных условиях. Уход за развитием пучка в поочередных пробирках с процедурой однократной подачи привел к более высокой последней жизнеспособности, вызывающей улучшенные последние титры по сравнению с контрольным условием. Результаты по однократной пробирке были подтверждены в биореакторах, вызывая более высокую последнюю жизнеспособность, расширенные титры и более высокую явную рентабельность с методологией однократной подачи.

Более низкое окисление цвета было оценено после расширения H2DCFDA до несмещенного pH, Cellvento™ Feed-220, содержащий подчиненный компонент, по сравнению с кормом в одиночку, показывающим более низкий потенциал восприятия. Более низкое внутриклеточное окисление цвета было выявлено путем расширения карбокси-H2DCFDA, чтобы превратить трубку с одной подачей в кластерные общества, показывающие более низкий внутриклеточный возраст восприимчивых видов при использовании подчиненного компонента. В момент, когда вносили в клеточные лизаты, подчиненный компонент цистеина использовался в качестве цистеина. Никакого различия в N-гликозилировании или изменении заряда в доставленном mAb не было обнаружено, что демонстрирует отсутствие влияния вспомогательного компонента на введенные основные качественные характеристики. Это исследование показывает, что вспомогательный компонент L-цистеина и PTyr2Na могут быть включены в беспристрастный pH-контроль и могут использоваться в качестве источника L-цистеина в кластерных формах, что приводит к более высокой явной эффективности по сравнению с лучшим в своем классе процессом без влияния на основные качественные характеристики mAb.